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细胞程序降温曲线优化技巧

时间:2020-06-08 浏览次数:507

时隔一年的今天,我又写了一篇有关程序降温仪的文章。不过这次想和大家探讨的,是程序降温仪配件使用的功能、必要性以及其他问题。

 

如前所述,尽管使用程序降温仪可实现对降温速率的“精细控制”,但在程序优化的实际操作过程中,还是会遇到很多问题。

 

首先是配件方面,在这部分我将阐述配件的功能及其必要性。

 

01 配件的功能、必要性

曾有客户问我是否需要使用样本温度探头,对此我的回答是:需要,而且必须

 

以Thermo CryoMed系列程序降温仪中的较为常用的Profile #1为例:

 

    

 

在这个程序中可以看出,整个程序设置参考了两个不同温度探头的测试数据。比如Step2中,一般需要等待样本温度和腔体温度一同降至4℃才可以开始下一步骤。后续我们解读曲线时就可以看出两个温度探头在不同阶段的温差相当大,我们在进行程序优化时,考察两条曲线的位置并作出合理调整,是程序优化的重要步骤

 

有些客户之前有使用过程序降温仪,但是仍然对于样本温度探头的使用必要性存在质疑。因为之前的使用经验表明,其实两条温度曲线测到的温度很接近。这种情况很可能是因为探头选择或者使用不当造成的。

 

选择一台好的程序降温仪,同时应该关注其样本温度探头的设计。针对不同的样本应有不同的解决方案。

 

以细胞程序降温中常用的冻存管血袋冻存为例。

冻存管

Cryomed程序降温仪采用的冻存管样品探头为针状,其使用时要求插入深度至少为样品液面1/2,探头尖端不得接触管壁。如果在您打印出来的温度曲线中无法拉开出两条不同温度曲线的距离,即使在潜热释放点附近两条曲线也几乎重叠或相距很近,极有可能是因为温度探头碰触了管壁,从而无法正确反映样本温度。

 

  

 

血袋冻存

血袋样品温度探头需压于血袋下方,并确保片状光滑面(无探头线突出来的一面)紧贴血袋。

 

另外,因为血袋为软结构,在冻存过程中发生相变会膨胀,所以务必使用可夹紧的血袋卡盒进行程序降温。如血袋不同位置的膨胀情况不同,可能导致冻存曲线无法正确显示温度变化过程,不利于后续的程序优化。

 

    

CryoMed血袋冷冻框

  

 

02 样本转移

其次是样本转移的问题。

 

有些客户觉得程序降温完成之后的样本转移过程比较复杂,希望用现有的冻存盒进行程序降温,后续可以直接转到液氮中进行存储。我觉得这是个非常好的想法,不幸的是针对这一问题,正确答案是不可以

 

    

程序降温仪中推荐使用的冻存管架

 

    

Nalgene冻存盒

 

我们可以先观察下程序降温仪中推荐使用的冻存管架和Nalgene冻存盒的结构区别。从材质上来看,冻存管架采用不锈钢构造,冻存盒采用Polycarbonate材质,两者的导热性相差非常大。从构造上来看,冻存管架为无密封结构,而冻存盒采用密封结构。这两种结构决定了在程序降温过程中,温度的均一性以及热量传导速度。

 

整个程序降温过程中,我们需要在相变的关键时期控制样本中温度的下降速度,其中涉及大量的热量交换过程。普通的冻存盒不利于完成这个过程。可能会对细胞复苏率造成影响,所以请勿自行替代。

 

降温完成后确实需要快速转移样品至液氮罐,让其原生质形成玻璃化状态。转移过程中谨防升温幅度过大,必要时您可以选择液氮小车来完成样本转移过程。

 

专为样本库量身打造的低温操作平台/液氮小车,可方便地将从存储罐内取出的样本进行暂存、分拣和转移,全部样本在全流程下处于-150℃的气相液氮环境。

 

    

 

程序降温过程中的关键步骤就是优化样本温度和腔体温度之间的关系。程序开始时,必须在样品温度与腔体温度都静置到相同的第一步温度时,才能再次按RUN开始第二步的降温。随着样本温度降低,潜热点开始出现。潜热点应该出现在缓慢降温的第二步结束进入快速拉大温差的第三步前期。如潜热点位置出现时刻不对,可根据冻存曲线图调整第二步的结束温度点,形成新的优化程序,并跑新样品验证。

 

    

 

程序降温曲线虽然很重要,但是复苏率才应该是检验程序降温过程更加重要的标准。所以有时即使曲线稍有异常,但只要复苏效果好,也不要过于执着于曲线的完美啦。

 

大家如对程序降温曲线优化还有任何问题,欢迎随时联系交流。

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