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如何练就细胞计数神功?

时间:2022-06-09 浏览次数:1221

01 细胞计数的重要性


对于大多数需使用细胞系的操作,如转染、细胞融合技术、冷冻保存和传代培养等,有必要在操作前对细胞数进行定量。因为如果接种细胞的密度过高,实验还没结束细胞就会出现接触抑制,影响细胞状态,蛋白的表达也会受到影响;但如果密度过低最后收集到的样品过少,检测不到,我们要花额外的时间等待细胞长到合适的密度。

 

使用相同数量的细胞将保持最佳生长,并有助于使用细胞培养的程序标准化,这反过来也使结果具有更好的再现性。所以细胞计数非常重要,它是一个实验成功的基础。

 

文章开头提到的血球计数板是以往细胞计数常用的方式,它的使用较为耗时,还易受操作者主观判断的影响,并且某些细胞类型,如形成簇的细胞类型,难以用这种方法计数。


 

0Scepter™3.0细胞计数仪 

 

现有的细胞计数设备可提供替代的细胞定量方法,这就包括我们的Scepter™3.0细胞计数仪。

 

Scepter™3.0细胞计数仪采用“计数金标准"库尔特原理


  • Scepter感应器吸入精确的样本体积;

  • 细胞穿过感应器小孔时,电阻值增加。电阻值的增加导致电压的增加;

  • 每个细胞经过时引起的电压的增加作为一个脉冲被记录下来;

  • 用直径和细胞数目绘制直方图,脉冲的大小代表细胞的大小,脉冲的数目代表细胞的个数。

最大的特点

  • 计数精准,提供基于细胞大小的直方图(如上图);

  • 手持式体积小巧;

  • 可以给出细胞体积;

  • 可以进行复杂的混合型的细胞计数;

  • 计数迅速,平均在30秒之内完成计数(最快14秒)。

 


0检测范围与应用

 

基于细胞直径以及样品浓度的感应器选择指南:

样本浓度范围

(个/毫升)

50,000-1,500,000个/毫升

10,000-500,000个/毫升

直径范围(µm)

4-20 µm6-36 µm

适合测量的颗粒直径范围

5-158-25
感应器规格40 µm60 µm

 

人体细胞中最小的是血小板,直径只有约2微米;最大的是成熟的卵细胞,其直径在200微米左右,鸵鸟卵细胞甚至可以达到长15~22厘米,直径14至15厘米。细胞的直径和大小会直接影响覆盖度百分比,同样的接种浓度,Cos7和293细胞最终的覆盖度有着极大的区别。

让我们来看看在分离PBMC后和流式直接对比的数据:

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞和单核细胞。外周血单个核细胞主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法。

 

离心获得PBMC后分别染色通过流式进行分群(Lymphocyte 和Monocyte)和计数,ScepterTM3.0的结果和流式在趋势上具有很好的相关性。

无论是分群还是计数的回归系数都达到了0.98以上。综上所述,Scepter3.0可以准确对PBMC细胞进行计数和分群。


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