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超滤法制备外泌体 | Amicon® Ultra超滤管应用方案

更新时间:2023-11-15 浏览次数:1821


默克Amicon®Ultra 超滤管采用低蛋白吸附的Ultracel®再生纤维素超滤膜,确保更精准的截留分子量和更高的蛋白回收率。因其优异的性能,Amicon®Ultra 超滤管已被广泛应用于多种样品制备的场景,包括蛋白/抗体/酶/核酸等生物样本的浓缩、脱盐和缓冲液置换、病毒/噬菌体/外泌体/囊泡/微粒等样本的纯化、药物筛选、药物结合实验、蛋白富集、小分子物质去除、分析样品前处理等,为科学研究提供高效的创新方案。

 
 

 

外泌小体(Exosome)是一种囊泡结构,直径通常在30-150nm,常见于正常体液和病理样本,培养细胞也可分泌。研究人员已经在血液、唾液、尿液、母乳等中发现外泌小体,其运载的蛋白和核酸涉及其细胞间物资、信息交流,影响和调控着多方面的生理功能,包括肿瘤发生、免疫促进、凋亡调控、血管生成、炎症反应及发育和分化等。由于在体液中出现,外泌小体对于临床生物标志物检测特别有利,成为体外诊断、biomarker研究的新热点。

 
 

 

之前我们有文章介绍通过PS(磷酯酰丝氨酸)亲和法提取外泌体,今天给大家介绍另外一种提取外泌体的方法——超滤法。说到超滤,那就不得不提默克的超滤管了,默克Amicon®Ultra 系列超滤管相信大家基本都有所了解,很多老师应该都有用过。

图片1(1).png

超滤法提取外泌体 
 
 

 

 两步法细胞上清的外泌体分离
 

 

 

操作步骤:从细胞培养上清中制备外泌体 

图片1(3).png

步骤01
 
样品澄清
 

1、将培养基上清从培养瓶中转移到50ml锥形管中;

2、旋紧Steriflip®组件(货号:SCGP00525,0.22µm,PES膜)至样品管顶部,打开样品管末端;

3、倒置组件并固定在基座或架子上;

4、将调节真空源连接到Steriflip®装置侧面的真空端口上。打开真空使溶液通过膜进入空管;

5、拆下Steriflip®装置并盖上样品。将过滤后的样品保存在4°C或进行囊泡富集。

 

本离心超滤方案基于使用AU-15超滤管(10kDa MWCO,#UFC901024) 处理15mL样品。如果要使用不同的体积或超滤管规格(AU-0.5,AU -2或AU-4mL),请参阅相应的Amicon®Ultra超滤管使用说明书。

步骤02
 
超滤管平衡
 

1、向超滤管中加入2ml PBS,盖上盖子,在4,000xg的摆桶转子中离心10分钟;

• 对于AU-2和AU-4,可以使用相同的离心机转速。如果要使用固定角度转子,请查阅设备用户指南以获得适当的转速和体积限制。
• 对于AU-0.5,样品在可容纳1.5mL管的固定转子中以14,000xg离心。

2、移去超滤装置底部未过滤的PBS,抽取收集管里的滤液。

• 对于AU-2、AU-4和AU-15,可通过移液器去除滤液。
• 对于AU-0.5,可1000 x g 反转离心2分钟去除滤液,移除收集管中PBS或更换新的收集管。

步骤03
 
样品超滤
 

1、像AU-15超滤管中加入15ml样品,盖上盖子;

2、 4,000xg离心30分钟;

备注:终产品体积通常大约500µL(30倍浓度),但根据样品的性质、流速和离心时间可能会有所不同。有关样品体积和终体积的估计,请参阅对应Amicon®Ultra超滤管使用说明书。

3、从离心机上取下超滤装置,弃除收集管里的液体;

4、往过滤装置中加入14mL PBS,移液器轻轻吸吐多次。4,000xg离心30分钟;
5、从过滤装置中回收浓缩样品;
• 对于AU-2、AU-4和AU-15,可用移液器吸取样品,并多次冲洗膜侧壁(每侧3-4次)以确保回收。
• 对于AU-0.5,将过滤器倒扣在干净的离心管中。在2000xg下离心1分钟,将样品转移到试管(反向旋转)。

6、细胞外囊泡样品准备好进行分析。

注意事项及补充提示:

• 无血清样品选择3kDa孔径是为了尽可能提高外泌体的回收率;
• 有血清样品选择100kDa/500kDa孔径是为了尽可能去除细胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌体的白蛋白造成的影响;
• 研究者可根据样品的粘稠程度,以及需要制备的目标外泌体/囊泡/颗粒的大小分布来选择和优化超滤孔径(3kDa/10kDa/30kDa/50kDa/100kDa),以便达到更好的得率和操作体验;
• 样品体积大于30mL时可以考虑用超滤杯或Centricon plus -70超滤管,请注意搅拌式超滤杯在200mL以内时吸附损耗可能较离心式超滤管略偏高;
• 如需进一步提高特定外泌体的纯度,可选用包被相应抗体的磁珠进行亲和纯化精制。

 

 超滤法制备的外泌小体参考数据  
 
 

 

多维度分析4个SH-SY-5Y细胞系的外泌小体样品(含或不含血清):

 

不同方法制备外泌小体产量比较 
 
 

 

图片1(6).png 

 


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