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原位杂交技术

时间:2023-01-09 浏览次数:346

  原位杂交技术属于核酸分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
 
  原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
 
  当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。
 
  原位杂交的技术要点主要是:杂交最适温度、杂交的严格性、保温时间、杂交促进剂。
 
  一、反应温度
 
  杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm10~15℃,碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链,错配对减少。
 
  若反应温度再低(Tm-30℃),虽然互补链之间也可形成稳定的双链,但互补碱基配对减少,错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA,调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍,因此在实验前必须首先确定杂交温度。
 
  通常有三种温度可供试验,即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。
 
  01
 
  最适复性温度(optimum renaturationtemperature,TOR):Tor=Tm-25℃
 
  02
 
  苛刻复性温度:Ts=Tm-(10或15℃)
 
  03
 
  非苛刻复性温度:Tns=Tm-(30或35℃)
 
  设置和调整杂交温度是原位杂交的重要环节,杂交温度应低于解链或融接温度20~30℃,多数杂交Tm为95℃,由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的黏附将产生不利影响,为此在杂交液中常增加甲酰胺浓度来降低Tm值,因每增加1%甲酰胺浓度可降低0.72℃。
 
  二、严格性
 
  杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性,一般认为可通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
 
  三、保温时间
 
  杂交反应时间在条件都得到满足的情况下,杂交的成败就取决于保温时间。时间短了,杂交反应不完成;时间长了也无益,会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20小时左右。
 
  杂交反应时间可随探针浓度的增加而缩短,杂交时间过短会造成杂交不wan全;杂交时间过长会增加非特异性着色,一般都采用杂交孵育过夜的方法,在黑暗环境下进行,可避免光线对甲酰胺的电离作用。
 
  四、杂交促进剂
 
  惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小,短探针本身的杂交率就高。
 
  常见的杂交促进剂有硫酸葡聚糖、聚丙烯酸、酚、硫氰酸胍。其中硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前常用的杂交促进剂。
 
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