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X-tremeGENE™转染试剂Protocol和答疑贴

更新时间:2023-01-30 浏览次数:948

今天Emma女士来和大家一起聊一聊转染,什么是转染呢?


PART 01 认识转染


转染——是指将外源基因如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学实验中,其应用越来越广泛。



PART 02 常见的细胞转染技术


细胞转染技术主要分为三大类:物理介导法、化学介导法及生物介导法:


物理介导法

一般是电穿孔法,适用于极难转染的细胞,如原代细胞,转染效率高,但转染后细胞死亡率也很高。


化学介导法

选用转染试剂与核酸结合,通过内吞作用进入细胞。一般转染试剂有以下三种:

  • 磷酸钙:成本低,但转染效率低,重复性差;

  • 阳离子脂质体:转染效率较高,但脂质体可能改变细胞的结构,对细胞毒性较大;

  • 非脂质体试剂:以脂类为主的多组分试剂,转染效率高,对细胞毒性低,且可生物降解。


生物介导法

病毒载体,转染效率高,但整合到基因组的风险大,基因长度也受限,比较适合构建稳转的细胞株。

所以,综合考虑到高转染效率和低细胞毒性的结合,请看下图:



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X-tremeGENE™360转染试剂在转染效率和低细胞毒性方面都胜出了ThermoFisher的Lipofectamine。


相信X-tremeGENE™系列也是大家熟悉的经典转染试剂,今天Emma女士再来给大家好好聊聊它。


X-tremeGENE™Roche公司的注册商标,我司东锐科技今年三月份也荣升为Roche的一级代理商。


X-tremeGENE™系列是非脂质体转染试剂,此系列转染试剂可以在含血清培养液中进行转染实验,不论是用DNA还是RNA转染,也不论是转染普通细胞系或者难转染的细胞系,都可以很轻松的找到适合的那一款。


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请看更详细的细胞类型对应表:

用GFP编码的pcDNA3.1质粒或者荧光素酶编码的pCI质粒转染细胞的实验,验证了以下细胞类型对应的转染试剂:


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✓:可以使用;✓✓:推荐使用;✓✓✓:最佳推荐使用


话不多说,上Protocol干货!


转染Protocol以转染12孔板中单孔细胞的量为


01 平衡试剂

X-tremeGENE转染试剂、DNA和稀释液平衡至15~25°C,轻轻Vortex转染试剂;

02 稀释DNA

用稀释液稀释DNA,稀释液可以选择无血清或者减血清培养基,稀释后的浓度为1ug质粒DNA/100ul稀释液(0.01ug/ul),轻轻混匀;

03 分装稀释后的DNA

分别吸取4管100ul(含1ugDNA)稀释液至四支无菌管中,管上分别标记1:1、2:1、 3:1、和4:1。建议使用无菌离心管或者组织培养处理过的圆底96孔培养板;


重要贴士:zui低稀释液的量是100ul,如果低于100ul会显著降低转染效率;

04  混匀转染试剂和DNA

分别吸取1、2、3、4ul转染试剂至刚加入100ul稀释液(含1ugDNA)的四支无菌管中,对应的标记为1:1,2:1, 3:1, and 4:1,注意转染试剂不要碰触到塑料管壁,再轻轻混匀;


重要贴士:避免影响转染效率,未经稀释的转染试剂请不要碰触到塑料管壁,并不要使用硅化处理的吸头或者吸管。

05 形成转染试剂/DNA复合物

将转染试剂和DNA混合物在15~25°C环境中孵育15分钟,形成转染试剂/DNA复合物。


重要贴士:对于某些特殊的细胞系或者低比例的情况可能需要更长的孵育时间,如达到30分钟。

06 转染细胞

从培养箱中取出培养容器,培养基可以不进行更换。以一滴滴加入的方式向细胞中加入转染试剂/DNA的复合物。


重要贴士:对于不同的培养容器,加入复合物的量不同,以12孔板单孔的量为例,每孔中(含1ml细胞培养基)加入100ul转染试剂/DNA复合物(含1ugDNA);


加入复合物后轻轻混匀培养皿或者培养瓶以保证复合物的均匀分布,如果条件允许,可以使用摇床低速混匀30秒。


一旦在细胞中加入了复合物,就无需再像其它转染试剂一样需要更换新鲜的培养基。

07 检测目的蛋白含量

转染细胞后将细胞继续孵育18-72小时。孵育的时间受许多因素的影响,如DNA载体、细胞类型、细胞密度、细胞培养基和表达蛋白的类型。


孵育之后便可以选择合适的方式进行蛋白的检测,如荧光定量或者免疫印迹等。

虽然我们有无比可靠的转染试剂,但是有时候为什么还是会出现实验结果不佳的情况呢?


别灰心,这时候我们需要放大双眼,来看一下Emma女士列出的要点,逐一排除原因,很快就可以做出理想的实验结果,绝对会给您未来发表的文章增色哦!


PART 03  转染试剂的技术答疑


Q:为什么转染效率不高?


未优化最佳的转染试剂与质粒的比例


影响细胞转染效率的因素较多,主要包括细胞生长状况、传代次数、转染试剂与质粒的比例和孵育时间、质粒大小等,其中转染试剂与质粒的比例尤为关键。


对于不同的细胞类型,转染试剂与质粒的最佳比例也不同。由于不同细胞表面结构、细胞膜、核膜等结构存在较大差异,同种转染试剂在不同细胞的转染效率也不尽相同。


因此,对于较难转染的细胞如原代细胞、神经细胞,为提高转染效率,必须对转染试剂与质粒的比例做进一步优化。


对于X-tremeGENE™系列的转染试剂,我们建议转染试剂与质粒的比例按照1:1、2:1、3:1、4:1(ul:ugDNA)四个比例进行测试,选出适合的比例,对于大多数细胞类型,3:1的比例是最合适的。


 细胞的数量不够

对于大多数细胞类型来说,建议在细胞密度70%-90%之间进行转染,过多或者过少都可能降低转染效率。


 未调整到最佳的孵育时间

转染后最佳的孵育时间为18-72小时,对于大多数的细胞类型和质粒来说,最佳的孵育时间是24-48小时。


 转染效率受培养基某些组分的抑制

培养基中一些组分如聚阴离子会影响转染,保证培养基中无这样的组分。


 转染试剂/DNA复合物的量过少

稀释后DNA的量zui低为100ul,过低的量会显著降低转染效率。



Q:为什么转染后细胞死亡率太高?


细胞密度不适合

对于大多数细胞类型来说,建议在细胞密度70%-90%之间进行转染,过多或者过少都可能降低转染效率。


 细胞在无血清培养基中进行培养

对于常规细胞来说,无血清培养基的营养成分不够,会降低细胞的存活率,虽然roche的转染试剂可以在无血清培养基中进行转染,但考虑到细胞需要血清营养成分的供给,应使用正常培养基或者减血清培养基。


 转染剂/DNA复合物未和细胞混合均匀

应该将复合物以一滴滴缓慢加入的方式加入细胞培养基中,然后轻轻地前后和左右晃动,使复合物均匀分布。


 使用了内毒素污染的质粒载体

质粒应该保证是高纯度无污染的,可以在提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样可以起到除菌的效果。


 质粒基因产物对细胞有毒害作用

高表达的质粒基因产物可能会使得细胞本身生长缓慢或者存活率下降。


 使用了过多的转染试剂/DNA复合物

阳离子转染试剂浓度过高时,由于带有很强的正电荷,对细胞有一定的毒性,导致细胞形态发生变化,细胞大量死亡,所以应降低复合物的浓度或者增加细胞的浓度。



PART 04   研究方向对应篇


快到文末了,如果您还没选择好您的转染试剂,也可以按照下面的表格来选择。


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(点击图片查看清晰原图)



如果有更多的问题,欢迎联系我们



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