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病毒浓缩 | Amicon® Ultra超滤管应用方案

更新时间:2024-01-04 浏览次数:1321

2023
基 因 治 疗

基因治疗是通过将特定的细胞功能改变的遗传物质引入患者来治疗遗传疾病。根据给药的方式可以分为:体内基因治疗(invivo)和体外基因治疗(invitro)。


  • 体内基因治疗指将携带治疗性转基因的载体直接注入患者体内。

  • 体外基因治疗包括从患者的细胞或异体来源提取细胞,通过携带治疗性转基因的载体进行基因修饰,再将该工程细胞重新导入患者体内。


基因治疗的关键步骤是如何有效地通过递送载体将基因传递到目标组织/细胞。根据载体的属性分为:病毒类递送载体和非病毒类递送载体。不同细胞类型的转染效率差异很大。因此,已经开发了多种病毒来源的载体系统,用于改善哺乳动物细胞中的cDNA转导、表达和筛选。这些系统包括COS细胞中的猿病毒40复制子(SV40)以及源自逆转录病毒、杆状病毒、甲病毒、人类免疫缺陷病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)的cDNA克隆和表达载体。以逆转录病毒、腺病毒(Ads)或腺相关病毒(AAVs)的使用最为广泛。


在临床试验中使用病毒载体相关的挑战包括生产足够数量的临床级材料和维持病毒载体的生物安全性。病毒载体的生产和纯化在方法和病毒产量和质量方面各不相同。病毒载体的生成和纯化是劳动密集型的且昂贵的,并且可能需要特殊设备(如超速离心机)。纯化腺病毒、慢病毒和AAV的标准方法是使用密度梯度超速离心,然后进行长时间透析。近年来柱或膜层析已成为腺病毒纯化的方法。病毒的产量通常通过空斑试验、TCID50测定和ELISA来确定。对于大多数应用,重组病毒必须纯化至高滴度。为了获得高滴度原液,通常需要浓缩纯化的病毒颗粒。


之前我们有文章介绍了使用默克Amicon®Ultra超滤管分离提取外泌体,今天给大家介绍超滤管的其它应用-浓缩病毒!下面介绍使用Amicon®Ultra离心超滤装置浓缩三种常见的病毒类型:慢病毒,腺病毒和腺相关病毒(AAV)。


01
实验步骤 


01
包装细胞

宿主细胞铺板以达到80-85%的汇合度。

02
转染

细胞转染重组质粒或感染活病毒颗粒。

03
收获病毒

根据病毒的不同,使用细胞上清液或沉淀细胞或两者兼而有之来纯化重组病毒粒子。通常应用三到四轮冻融循环从细胞中释放病毒。然后通过离心或预过滤将细胞碎片与细胞裂解物分离。

04
病毒纯化

通过密度梯度超速离心或柱/膜层析从细胞裂解物中纯化病毒。在某些情况下可以使用肝素或粘蛋白琼脂糖的亲和色谱。然后将纯化的病毒溶液通过透析或渗滤完成将缓冲液置换成适当的储存溶液。

05
病毒浓缩

为了获得高滴度的病毒原液,可以使用离心超滤浓缩纯化的病毒。


备注:正确选择设备、膜材料、MWCO、离心速度、离心时间和缓冲液组成对于感染性病毒颗粒的高回收率至关重要。


Amicon®Ultra超滤管采用50KDa NMWL Ultracel® 再生纤维素膜,已被证明可以成功浓缩腺病毒和AAV溶液。对于慢病毒浓度,可以使用50KDa和100kDa膜的超滤管。


02
实验结果 


下表显示了粗制细胞裂解物和色谱纯化的病毒中腺病毒、慢病毒和AAV浓度的典型结果。


表1:采用Millipore®超滤产品浓缩病毒


特别注意

①我们不建议将病毒浓缩到超过1013颗粒/mL的浓度,以避免可能出现的病毒聚集。


②大多数病毒不能有效地浓缩并储存在低盐缓冲液中。病毒在浓度为<250mM盐浓度的溶液中离心将导致病毒聚集和传染性降低。推荐储存溶液配方是:20mMTris、pH8.0、250mMNaCl、5%山梨糖醇和0.001%PF68(多聚糖酸)。


浓缩的病毒原液也可以通过0.22μm过滤器进行过滤灭菌。例如,无菌Steriflip-GP®过滤装置(目录号SCGP00525)可用于50mL或以下的体积或Ultrafree®MCGV(目录号UFC30GV0S)可用于体积<0.5mL的样品。对于较大体积的样品,则可使用70%消毒处理过的Amicon®Ultra或Centricon®Plus70超滤管浓缩。


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