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选择抗体时的“九个大坑”,你中招了吗?

时间:2018-10-30 浏览次数:8933

近咱们技术部门的小姐姐接到好多用户朋友的询问,说“不了解正在研究的蛋白用哪个抗体合适”。

也有用户朋友经常询问“说明书中写着可以用于ICC/IF,那我做组织的荧光成像是可以的吧?

其实在选择正确抗体的道路上,存在很多“坑”,只要成功避开,就可以选到适合您实验的抗体。

今天就来和大家分享一下“如何选择正确的抗体”。

1、蛋白的名称和亚型

咱们销售员经常拿到一些“似是而非”的英文名称或简称,查的时候不确定推荐的是否就是用户要检测的靶标。针对这个问题,建议大家参考SwissProt蛋白数据库,每个abcam说明书的 “数据库链接”部分,有针对不同种属的基因和蛋白数据库链接, 其中显示SwissProt的就是该蛋白的数据库链接,点击进去后,在页面的左边有筛选框,可以点击您感兴趣的部分查看。

 

点击Names&Taxonomy部分,可以看到该靶标的基因名称和蛋白名称,以及替代名称,也就是所谓的“小名”,看下您提供的名称是否可以对应上,如此判断该抗体是否适合。

 

另外,关于蛋白亚型问题,在这里也可以找到答案,点击Sequences部分,可以看到该蛋白有几个亚型,每个亚型的具体氨基酸序列和分子量大小,如果您正好做WB实验,就可以预估您的实验结果,即可能检测到的条带位置。

 

不能不说,SwissProt数据库实在太强大了,咱们用户常常问到的亚细胞定位-Subcellular location,翻译后修饰-PTM/Processing部分,具体的修饰位点和修饰基团等,都可以一一查看到。

2、抗体的应用范围

常见的免疫学实验,在abcam的说明书中,主要包括如下几种应用:WB, IHC-P,IHC-Fr,IHC-FrFl,IHC-Wmt,IHC-FoFr,ICC,ICC/IF,IP,ChIP,ChIP/Chip,ELISA,EM,Flow Cyt等等,相信大家看到这些英文单词也会一头雾水吧,单单一个免疫组化-IHC,就可以细分这么多操作方式,而且在不同的品牌,不同英文单词代表的含义还不尽相同,建议大家在选购前,询问清楚不同品牌对应的定义和质保范围。

如在abcam产品说明书中,IHC-P即免疫组化石蜡切片,且实验室内部验证时,是搭配酶标二抗,用DAB显色的方式检测的;IHC-FR即免疫组化冰冻切片,内部验证时,是搭配荧光二抗,用荧光成像的方式检测的;IHC-FoFr是冰冻灌注切片;IHC-FrFI是冰冻切片漂片;ICC/IFICC都是特指细胞水平的荧光成像,值得注意的是,这里ICC/IF里的IF很多人会误认为既包括组织也包括细胞的荧光成像,导致选错抗体,做不出结果。

3、抗体能识别的样本种属

常见的检测种属,经常如下描述:ReactivityHuman, Mouse, Rat, Sheep, Rabbit, Chicken, Hamster, Cat, Dog, Carp, African green monkey, Opossum, Chinese hamster, Common marmoset, Meriones unguiculatus.

有时还会见到如下描述predicted: Cow, Pig, Mammals

请大家务必注意:在abcam的说明书里,Reactivity后面列到的种属是可以质保的,而predicted到的种属则是根据该蛋白在不同物种中的同源性比对数值,做出的推测。推测的种属并没有经过实验室验证,是不能质保的,仅供参考。

4、抗体的动物来源

抗体的动物来源即抗体的宿主物种,常见的有RabbitMouseRatChickenGoatSheep等,当您选购抗体时,建议尽量选和检测样本种属不同的宿主物种,即您检测mouse,尽量选择非mouse来源的抗体,可以选rabbit源的抗体。

5、制备抗体的免疫原

在说明书中的免疫原,即Immunogen 部分,经常如下描述,Synthetic peptide within Human X aa 200-250. The exact sequence is proprietary.或者Recombinant full length protein corresponding to X这里的X指的是蛋白的名称).建议您根据您的实验目的,去选择合适的抗体,如果您没有特殊实验要求,那么全长的免疫原序列是不错的选择。

5、单克隆抗体和多克隆抗体

经常有用户问到,单克隆还是多克隆抗体好?其实在回答这个问题前,我们要先解释下这两者的含义,简单来讲,单克隆抗体只能识别抗原的特定抗原表位,而多克隆抗体可以识别抗原的多个抗原表位,所以,单克隆抗体特异性高而灵敏度相对低一些,多克隆灵敏度高而特异性低一些,在不同实验操作时,可以根据如下表格有侧重选择。

 

 

 

单克隆抗体

多克隆抗体

特异性

 ++

 +

批间差

 ++

 +

灵敏度

 +

 ++

WB

 +

 ++

IHC

 +

 ++

ICC

 ++

 +

FlowCyt

 ++

 +

 

7、抗体的克隆号

克隆号是指定给单克隆杂交瘤细胞产生的抗体的编号。每个杂交瘤细胞克隆产生单个纯同质型抗体。克隆号相同的抗体代表制备抗体时的免疫原序列是相同的。

8、抗体的偶联物

常见的偶联物有酶、荧光素、生物素等,常见的酶有辣根过氧化物酶-HRP、碱性磷酸酶-AP等,常见的荧光素有传统荧光素FITCAPCPePe-cy3Pe-cy5等,新型荧光素包括Alexa Fluor® 系列和DyLight® 系列各波长的荧光素,一般做多重免疫染色时,会考虑选择直接标记荧光素的一抗,建议您先核实实验室仪器的荧光显微镜或流式细胞仪的配置,选择匹配仪器的激发波长或通道的荧光抗体,尽量避免光谱重叠。

如果您需要寻找双标记和三标记免疫荧光染色实验中的常见组合,我们推荐如下:

免疫染色

抗体组合

双色

Alexa Fluor® 488Alexa Fluor® 647

三色

Alexa Fluor® 405Alexa Fluor® 555Alexa Fluor® 647

 

9、抗体验证

这里我们重点说下目前有说服力的基因敲除验证,KO验证,该方法使用单倍体细胞模型的 CRISPR/Cas9 KO 人类细胞系。敲除模型是真正意义上的阴性对照,是抗体验证的标准品。

基因敲除模型通过观察基因功能缺失的表型来了解特定基因的功能,这正是该模型的强大之处。目前,abcam有超过1600种的经过敲除验证的抗体,过去的一年中,还将 200 多种非特异性抗体从abcam的产品目录中移除。当然敲除验证仅是为提高抗体质量标准所采取的众多步骤之一。

以上就是在抗体选择道路上常常遇到的问题,希望对大家有所帮助。广州东锐科技有限公司和广州新晋生物科技有限公司作为abcam在华南区的一级授权代理商,为您的科研保驾护航,帮助您更快地达成科研使命。

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